孝明天皇“攘夷赦紙”
時局的變化沒有使晉作隱居多久。1863年，在長州藩等尊攘派推動下，孝明天皇發出攘夷赦紙，將軍被迫向朝廷保證“攘夷之事確定以6月25日(陰曆5月10日)爲期。”6月25日，長州藩首先點起了攘夷的火焰。以久阪玄瑞爲中心，以光明寺爲大本營的尊攘派志士——所謂的光明寺黨，斷然開炮襲擊了通過下關海峽駛往長崎的美國商船“彭布羅克號”。7月8日炮擊了法國通訊船“建昌號”，11日，炮擊了荷蘭軍艦“梅迪薩號”。16日，美國軍艦“懷俄明號”對長州藩炮臺和軍艦進行了報復性的猛烈攻擊，擊沉三艘長州軍艦，並封鎖了下關海峽，沿岸的武士家屬以及部分百姓紛紛逃往山中，海峽地區出現冷落的情景。法國東洋艦隊也派出旗艦“塞米拉米斯號”和“唐克雷德號” 進行報復，於21日來到下關和長門之間的前田炮臺前面發動攻擊，約有250名陸戰隊員登陸，佔領了前田、壇浦等處炮臺，並燒燬了沿途村莊。長州藩志士們進行了頑強抵抗，但實力相差懸殊，列強們的堅船利炮使他們受到嚴重損失。 長州藩風雨飄搖，處於被侵佔的邊緣。
建立“諸隊”
1863年7月18日，長州藩起用高杉晉作，命其防守下關。19日，高杉晉作組織了奇兵隊。奇兵隊名稱的含義，是與藩裏的正兵(正規軍)相對而言的非正規軍。晉作的方針是要組織一支強有力的軍隊。他認爲，上層藩士沒有用處，只知錦衣玉食，既無體力又無智力。
所以他在組織奇兵隊時，無論身份高低而起用人才，招募自願參加的一般農民、商人和手工業者，但主要是藩內最下層的武士。從1864年的559名奇兵隊員的身份看，武士佔48.7%,農民佔42.3%,商人市民佔4.5%,神官僧侶佔4.5%。奇兵隊所有的服裝、武器操練均效仿西歐各國，這是日本第一支的新式軍隊。奇兵隊在組建後，立即將矛頭對準了“對內專制，對外妥協”的幕府統治。年僅24歲的高杉晉作親自擔任了奇兵隊的總督，不久於10月份去職。奇兵隊發展迅猛，到1864年已經達到了4000多人，並且得到了很多豪農豪商的支持。奇兵隊的出現，開創了日本新式軍隊的歷史，帶動促進了一些士庶混雜的民衆武裝的紛紛出現。這些武裝的名目繁多，如“農民隊”、“力士隊”、“先鋒隊”、“八幡隊”、“集義隊”、“義勇隊”、“荻野隊”和“游擊隊”等，不下幾十種之多，少則三五十人，多則三五百人。以後由高杉晉作統一指揮，泛稱爲“諸隊”。這種新式軍隊逐漸成爲倒幕維新運動中可靠的武裝力量。
尊攘派八·一八政變
尊攘派看到孝明天皇叫幕府發佈定期攘夷佈告等赦令的威力，竟使幕府出現動搖不穩的狀態，便大膽起來。尊攘派領導人之一真木和泉策劃天皇行幸大和(今奈良縣一帶)，親征外夷。屆時，對隨行的將軍突然下令，迫使他立刻採取攘夷行動，如其不接受敕令，就通令各藩起來舉兵倒幕。這時攘夷已變爲推翻幕府政治的手段了。孝明天皇雖然要求攘夷，但卻一貫主張公武和體，十分信賴爲公武和體而奔走的薩摩藩和力圖挽救宗主德川家危機的會津藩。7月5日，突然發生了暗殺尊攘派公卿姉小路公知的事件。14日，尊攘派指名薩摩藩士田中新兵衛是兇手，並勸說朝廷解除了薩摩藩守衛乾門的職位。但是，天皇卻寫信給青蓮院宮，說此乃“僞敕所下之令”。8月9日，尊攘派爲把監視尊攘派活動的京都守護職鬆平容保趕出京都，又說服朝廷向容保發出敕令，命其視察關東形勢。13日，天皇卻寫信給容保，說明此“並非實敕”。於是會津、薩摩兩藩協商策劃舉行軍事政變，並得到青蓮院宮的支持。9月25日(陰曆8月18日)，會津、薩摩兩藩聯合以兵力固守宮廷九門，尊攘派藩士和公卿被迫逃往長州藩，史稱“八·一八政變”。這時，長州藩成了尊攘派勢力會聚的據點。
長州的奇兵隊到1864年時已達四千多人，有了一定的實力，並得到豪農豪商的支持。於是，尊攘派志士們鬥志昂揚，但也有些人產生了急躁情緒。真木和泉和久阪玄瑞就要率兵進京，以恢復尊攘派過去在京都的勢力。高杉晉作認爲力量尚不足，時機也不成熟，應該繼續積蓄力量，待機而動。於是他便來到軍隊駐地三田尻勸阻真木和泉等人。但和泉等人一意堅持己見，反而嘲笑晉作是懦夫。不久，真木和泉和久阪玄瑞因“池田屋事件”的發生而急速率兵來到京都。晉作因爲勸阻無效，遂放棄了向藩主報告的義務而奔向京都，後因脫藩罪被關在萩市監獄。
禁門之變
1864年7月，京都守護職指揮下的新選組，襲擊並消滅了聚集在京都池田屋的尊攘派地下組織(池田屋事件)。這件事情激怒了奇兵隊，8月，奇兵隊在真木和泉和久阪玄瑞的領導下，向京都開進。高杉晉作在勸阻無效的情況下，放棄了向藩主報告的義務而奔向京都，就因這個緣故，他被判爲脫藩罪，關進了萩的野山監獄。因禍得福，也正因爲這個緣故，高杉才躲過一劫。8月19日夜，真木和泉和久阪玄瑞開始攻擊京都皇宮的蛤御門，與守門的會津兵展開激戰，不料遭到側面的薩摩伏兵突然襲擊而失敗，真木和泉和久阪玄瑞等尊攘派領導人大多都被殺或自殺死去，這就是“禁門之變”。而高杉因在監獄而未能參加此戰。
