天保10年8月20日(1839年9月17日)，高杉晉作出生在長門國秋城下菊屋橫町(現山口縣萩市)，爲長州藩士高杉春樹(高杉小忠太)長子。高杉家家格爲大組士，俸祿200石。
十歲時得到皰瘡。先在漢學塾學習，嘉永5年(1852年)進入藩校的明倫館並且學習劍術。
1857年(安政4年)，他拜松下村塾的吉田松陰爲師，與久阪玄瑞並稱鬆門雙璧，加吉田稔磨爲鬆門三秀，加入江九一爲鬆門四天王，後成爲明倫館的塾頭，並當了藩主之子的身邊武士小官參與藩政。吉田松陰的頑強探索精神和對幕府腐朽政治的猛烈攻擊，以及學以致用的主張和教育平等的思想，對晉作後來的發展產生了深遠的影響，並經吉田松陰介紹與佐久間象山知交。1859年，吉田松陰死於“安政大獄”，這件事更加深了他對幕府政治的痛恨。
1858年，晉作到江戶幕府學校昌平潢去深造。他在寫給長州藩家老益田彈正的信中闡述了富國強兵的主張，指出“富國之本在於節儉”，“富國之末在於國產”，“強兵之本在於統一人心”，“強兵之末在於使兩州(周防和長門)之人學習洋術”。鬆陰對此讚歎到：“嗚呼，此誠我國之文章。”1860年，晉作與山口町奉行井上平右衛門的次女雅子結了婚，並進入軍艦教授所學習航海術。不久，他又到東北地方去遊學，先後會見了會澤安，加藤有鄰，佐久間象山和橫井小楠。在旅行中，他開闊了眼界，特別是欣賞佐久間象山批判幕府、倡導開國的主張，並吸收了橫井小楠鼓吹開國，富國強兵的思想。他開始批判舊學(儒學與國學)，提倡實學，熱情地學習和傳播洋學，開始邁上了向西方資產階級文明學習的道路。從東北地方遊學回藩後，晉作擔任了明倫館都講(學官)。1861年，藩世子提升他爲江戶藩邸的小姓役(侍從)。
1861年，藩主允許晉作到海外視察，並於次年派往中國。2月，當幕府爲前往上海進行貿易而派出“千歲丸”時，他便同薩摩藩的五代友厚和佐賀藩的中牟倉之助一起隨船前往。當船路過長崎時，他考慮“長崎互市之策”，認爲“如能與美、法、英諸夷對話，則將大有裨益”。6月初，“千歲丸”駛抵上海，當時太平天國革命正處於高潮中。晉作在上海逗留的兩個月裏，採取一切可能的辦法觀察中國形勢。在他收集的有關太平天國的情報中，也記載過太平軍守信義，但他更多接觸到的是從江南各地躲避戰亂而逃到上海來的地主士紳和地方官員，聽到他們對太平軍的誣衊，因此對太平軍產生了反感。如中國士紳顏麈告訴晉作說：“弟自舊冬避長毛賊至此。今春三月，家屋已被焚燬，家中書籍金石圖書一併而空，慘難言狀。”高杉晉作表示：“聞之使人潸然淚下。”在高杉晉作的眼裏，中國的風貌已蕩然無存：津港裏面外國商船穿梭競逐，市街上外國商館鱗次櫛比，一隊隊水兵從軍艦上下來執行任務，蘇州河上的外白渡橋只對外國人免費開放……他指出：“上海之勢可謂大英屬國矣”，“次決非隔岸之火……孰能保證我國不遭此事態?險矣哉!”
逗留期間，五代友厚對晉作說：“儘管太平軍有超人之勇，但在少數英法軍隊面前遭到慘敗，今後是新式大炮和軍艦的時代。”晉作深以爲是，並邀友厚一起去觀看新式大炮。他認爲：清政府之所以衰敗，乃在於其不識防禦外夷於外海之道。即不造能闖過萬里波濤之軍艦，也不造能防禦敵人於數十里之外的大炮，並使彼國志士所譯之《海國圖志》絕版。因循苟且，空渡歲月，徒然提倡固陋之說。
該年8月，晉作一回到長崎，就自作主張匆忙代表本藩與荷蘭商人草簽了購買軍艦的協定，這不僅爲藩裏拒絕，還被傳爲一時笑柄。9月，他在京都向正爲斡旋公武合體而進京的藩主敘述了中國的形勢，然後就前往江戶，在勤學院中就任御用掛(負責官員)。不久高杉晉作參加了席捲全國的攘夷運動，目的是迫使本藩不再斡旋於公武合體之間，把力量放到防長兩藩國的富國強兵上來，即實現割據。1863年1月，晉作在神奈川的下田屋與久阪玄瑞等11人歃血盟誓，策劃暗殺外國人。1月31日，他親率13人火燒正在江戶品川御殿山施工的英國公使館。對於高杉晉作來說，襲擊公使館雖在形式上是攘夷，但他的目的是要求實行割據，得到藩政府的同意後，便效仿西行法師故事，自號東行，剃髮隱居於萩市。
