戊戌變法失敗後，光緒皇帝被慈禧太后囚禁。光緒皇帝在度過了10年沒有人身自由的囚徒生活後，於光緒三十四年十月二十一日(1908年11月1日)死亡，終年三十八歲。
緊接着，第二天，即光緒三十四年十月二十二日，慈禧太后在儀鸞殿死亡。
在22小時之內，這對母子相繼去世，死亡時間的詭異與巧合，光緒帝與慈禧之間早已存在的政治矛盾，不得不讓人感覺，光緒帝的死亡背後，深藏着一個驚心而巨大的陰謀。由此，繁衍出種種猜測和議論。
第一種說法：慈禧知道自己即將歸西天，不願意在他死後，光緒皇帝重新掌權，派人毒死了光緒帝。主要依據有清末給光緒看病的名醫屈桂庭他的回憶錄中說：“光緒在臨死前三天，在牀上不停地翻滾，並且不停地大叫，‘肚子疼得不得了。’臉色發暗，舌頭又黃又黑，明顯是中毒症狀。”根據這種說法，光緒是被毒死的，最大的嫌疑人是慈禧太后，因爲她是當時最有權勢，又嚴密控制光緒帝的，最好下毒、最可能下毒的人。
此說法的依據和記錄有《清室外記》《清裨類鈔》和《崇陵傳信錄》。
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第二種說法：袁世凱見慈禧一病難起，怕慈禧死後，光緒掌握實權，報復自已在戊戌變法出賣皇帝的行爲，於是賄賂宮廷宦官，用劇毒藥物害死光緒帝。這種說法最有權威的依據是清朝最後一個皇帝溥儀的說法，溥儀說：“我親耳聽到一個侍候光緒帝的老太監講，光緒帝死前一天，只是用了一劑藥，才變壞的。後來才知道這劑藥是袁世凱送的。
第三種說法：太監李蓮英得悉光緒帝的日記中載有西太后死後將誅袁世凱和他的消息，與慈禧一起陰謀將毒藥投入光緒的食物中致使光緒帝中毒身亡。
第四種說法：這幾年來有專家根據光緒帝生前的病歷，結合當時的歷史背景和現代中醫學理論，推斷是光緒帝因爲嚴重肺結核病加上其他併發症，導致死亡的。
歷史背景的根據是光緒二十五年正月初二日，太醫朱琨等爲光緒帝診得脈案：“口渴思飲，喉癢嗆咳，氣不舒暢，心煩而悸，不耐事擾，時作太息。目中白睛紅絲未淨，視物矇矓……耳內覺聾，時做轟聲。胸中發堵，呼吸語言，丹田氣覺不足……夜寐少眠，醒後筋脈覺僵，難以轉側……”
第五種說法：光緒帝有嚴重的腎虧，加上光緒帝從小身體虛弱，幼多病有長期遺精史。《病原述略》中說：“遺精之病將二十年，前數年每月必發十數次，近數年每月不過二三次……冬天較甚。近數年遺泄較少者，並非較愈，乃系腎經虧損太甚，無力發泄之故。光緒帝有這樣一種病症，再加上從幾歲起就受慈禧的壓制，長期處在緊張之中，後來又在做皇帝時更是經歷一連串的挫折和打擊，病情逐漸加重，引起一系列呼吸道、消化道等併發病症，最後病亡。這一說法主要依據是光緒生前的病歷和光緒生前自己的一段回憶。
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究竟哪一個說法更接近於事實呢?光緒帝的確切死因到底是什麼?史學界關於光緒死因的辯論從未停止，懷疑謀殺說和正常死亡說幾經交鋒，卻一直沒能形成學術定論。
而據最新的研究認爲，光緒帝是死於砒霜中毒。中國原子能研究院反應堆工程研究設計所、北京市公安局法醫鑑定中心，先後提取了光緒分別長26釐米、65釐米的兩小縷頭髮，清洗後晾乾，剪成1釐米長的截段，逐一編號、稱重和封裝，然後用核分析方法逐段檢測光緒頭髮中的元素含量。
結果顯示，光緒頭髮中含有高濃度的元素砷，且各截段含量差異很大，第一縷頭髮的砷高峯值出現在第十段(2404微克/克);第二縷頭髮的砷高峯值出現在第二十六段(362.7微克/克)和第四十五段(202.1微克/克)。而同時對比測試的頭髮砷含量，當代人爲0.14～0.59微克/克，與光緒同時代並埋在一起的隆裕皇后爲9.20微克/克，清末一個草料官乾屍頭髮爲18.2微克/克。
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後來，又按照規範的法醫檢驗要求和方法，提取了光緒遺骨及衣物樣品測試，結果肩胛骨、脊椎骨和每件衣物的胃區部位、繫帶和領肩部位的含砷量很高;內層衣物的含砷量大大高於外層。再對光緒棺槨內、墓內物品和陵區水土等進行對比實驗，結果表明光緒頭髮上的高濃度砷物質並非來自環境沾染。最後他們得出結論：光緒頭髮上的高含量砷並非爲慢性中毒自然代謝產生，而是來自於外部沾染;大量的砷化合物曾存留於光緒屍體的胃腹部，屍體腐敗過程進行再分佈，侵蝕了遺骨、頭髮和衣物。而砷化合物也就是劇毒的砒霜。
經過科學測算，光緒攝入體內的砒霜總量明顯大於致死量。
按照這一研究，那麼就與第一種說法一致——光緒帝是被謀殺的，那麼謀害他的最大犯罪嫌疑人就是慈禧。
