井伊直虎是遠江井伊谷城主(國人)井伊直盛的女兒，母爲新野親矩之妹祐椿尼。幼名不明，出生年份不明，推測天文5年(1536年)前後誕生。
早年出家
天文11年(1542年)，井伊直虎的祖父井伊直宗因爲今川義元的命令參與三河國田原城的攻城戰而戰死。父親井伊直盛因爲沒有兒子，打算將其堂弟井伊直親(直盛的叔父井伊直滿的兒子)作爲自己的婿養子。
天文13年(1544年)，因爲井伊氏的家老小野道高(政直)的讒言，井伊直親的父親井伊直滿及其弟弟井伊直義被懷疑要向今川義元謀反而被迫自殺，直親也因此逃亡到信濃國。在井伊直親逃亡期間，井伊直虎(此前幼名不明)出家爲尼，取名爲次郎法師。
弘治元年(1555年)，井伊直親在道高死後一年纔回到今川家，但在信濃的期間，娶了奧山親朝(另一說是奧山朝利)之女爲正室，因此只能解除與次郎法師的婚約。
永祿3年(1560年)5月，井伊直盛在桶狹間之戰中戰死。
永祿5年(1562年)，井伊直親繼承家督，但又因爲小野道好(道高之子)讒言被今川氏真賜死。井伊一族曾因此受到連累，在舅父新野親矩(次郎法師母親祐椿尼的兄長)的擁護下而獲救。
永祿6年(1563年)，曾祖父井伊直平在進攻天野氏的犬居城的途中去世。依據《井伊直平公御一代記》的記載(詳見井伊家傳記)，是因爲喝了曳馬城(1570年德川家康入城後改名爲濱鬆城)城主飯尾連龍妻子田鶴方(椿姬)的毒茶而死亡(遠州惣劇)。
永祿7年(1564年)，因今川氏聲勢衰退不止，引發飯尾連龍等人叛亂，新野親矩及直盛的重臣中野直由代表今川一方討伐曳馬城(引間城)而被殺死。身爲龍潭寺住持的叔父南溪瑞聞獲悉後，將直親的幼子虎鬆(後來的井伊直政)移送到鳳來寺。
繼任家主
永祿8年(1565年)，由於家中沒有男丁，次郎法師還俗，並以井伊直虎的男兒之名繼承井伊家督之位。
永祿11年(1568年)，小野道好進攻井伊谷城。同年，由於小野專橫，井伊谷三人衆(近藤康用、鈴木重時、菅沼忠久)尋求德川家康幫助。12月15日德川家康遠州侵攻，在家康協助下井伊直虎得回實權，小野道好開始逃亡。然後井伊氏爲了復仇而攻入引間城(在丈夫死後，成爲城主的田鶴方因此自殺)。
元龜元年(1570年)，德川家康追究小野道好陷害直親之事，處死被捕的小野道好。
元龜3年(1572年)秋，武田信玄部將山縣昌景攻略井伊谷城，井伊直虎在井平城防衛戰敗退後逃亡浜鬆城。之後濱鬆城的織田·德川聯合軍在三方原合戰及隔年的野田城之戰遭到武田軍的潰敗。
元龜4年(1573年)4月，武田信玄病倒，武田軍撤退，井伊直虎奪回井伊谷城。
在井伊直虎擔任城主的期間(1565年起)，收直親的遺兒虎鬆(井伊直政)爲養子。
天正3年(1575年)，15歲的井伊直政以三百石出仕德川氏。
天正10年8月26日(1582年9月12日)井伊直虎病逝，家督由21歲的井伊直政繼承。葬於井伊家的龍潭寺，與直親合墓。
